x

Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipisicing elit, sed do eiusmod tempor incididunt

Seqüenciació i Bioinformàtica de FISABIO-Salut Pública

Seqüenciació massiva d’última generació, un món de possibilitats.

Per Mariana Reyes

M.Sc. Bioinformatician

Seqüenciació i Bioinformàtica de FISABIO València

Sobre mi: https://orcid.org/0000-0001-6292-2420

@ranitared

Benvinguts a la primer entrada del blog del Servei de Seqüenciació i Bioinformàtica de FISABIO! Estem molt il·lusionats per embarcar-nos en aquesta nova aventura, a través d’aquest blog volem donar-vos a conéixer notícies interessants relacionades amb el nostre treball. Un dels nostres majors compromisos com a servei és ajudar les nostres usuàries i usuaris a entendre i triar les millors plataformes per a les vostres necessitats de seqüenciació, així com a explorar totes les anàlisis bioinformàtiques possibles, atés que oferim tant anàlisis estàndards com personalitzats.

Per a donar-nos a conéixer millor, aquesta primera entrada al blog serà una presentació, d’una banda descriurem què és la seqüenciació massiva i d’una altra us comentarem les plataformes amb què actualment comptem en el Servei.

Bàsicament, la seqüenciació massiva reuneix un conjunt de mètodes i protocols bioquímics per a determinar la seqüència dels quatre components bàsics de l’ADN (l’adenina, timina, citosina i guanina) o ARN (adenina, uracil, citosina i guanina) d’un gen, un amplicó, un genoma, i/o de material genètic de qualsevol ecosistema que siga del nostre interés. Una de les meravelles d’aquestes metodologies és que ens permeten desxifrar la informació genètica des d’una única cèl·lula, fins a comunitats molt complexes.

Aquestes tecnologies tenen moltes aplicacions, entre les quals destaquem l’assemblatge de novo de genomes, l’assemblatge assistit basant-nos en un genoma de referència, el genotipatge de variants amb base en una referència, estudis funcionals (transcriptoma), la descripció de comunitats microbiana o de fongs d’un ecosistema (metataxonomia), la metagenòmica i la metatranscriptòmica.

Fins al moment les tecnologies més utilitzades han sigut les anomenades de segona generació o “Next Generation Sequencing”, per comparació amb la seqüenciació Sanger de primera generació. Aquestes tècniques de segona generació es caracteritzen per produir una gran quantitat de dades d’eixida en temps molt curts i costos molt continguts respecte al mètode de Sanger. Tot això aconseguit gràcies a la paral·lelització de les reaccions de seqüenciació. El seu principal defecte fins ara ha sigut la curta grandària dels fragments que es poden seqüenciar i que l’amplificació clonal a la qual se sotmeten aquests fragments prèviament a ser seqüenciats introdueix biaixos considerables. Per a evitar aquests problemes, s’ha desenvolupat una tercera generació de seqüenciadors amb noves tècniques molt més sensibles de detecció que eviten l’amplificació clonal necessària en la segona generació, i suma a més la possibilitat de seqüenciar fragments considerablement més llargs.

A continuació descriurem els seqüenciadors disponibles en FISABIO.

Seqüenciadors de segona generació

Comptem amb diversos seqüenciadors de tecnologia Illumina, concretament els models MiSeq i NextSeq500. La diferència entre tots dos resideix en la grandària màxima del fragment a amplificar i en l’output màxim d’eixida de dades, que és de 2x300pb i un màxim de 15 Gigabases o 25 milions de lectures per al MiSeq i de 2x150pb i 120 Gigabases o 400 milions de lectures per al NextSeq.

Per a una guia completa de tots els protocols de seqüenciació i les aplicacions que ofereix Illumina tant per a ADN com ARN, podeu entrar al següent enllaç. Si teniu algun interés particular, podeu contactar-nos per a parlar de les especificacions que necessiteu.

Si bé hi ha centenars d’aplicacions de mètodes de seqüenciació i anàlisi, en el nostre servei els abordatges amb les plataformes de Illumina més comunes són:

  • Seqüenciació de amplicons. Per exemple tant aplicacions relacionades amb la biomedicina com amb la microbiologia estudiant la diversitat dels fragments amplificats.
  • Seqüenciació de genomes complets. Podem obtindre el genoma complet tant de bacteris i virus com de xicotets eucariotes (llevats, …)
  • Reseqüenciació de genomes complets. Per exemple per a genotipar variants, una eina de molta importància en l’epidemiologia molecular.
  • Seqüenciació de transcriptomes. Ens permet conéixer les funcions que s’expressen en un moment determinat, o per a conéixer el conjunt total de RNA en una mostra.
  • Seqüenciació de metagenomes. On explorem els genomes bacterians en una mostra representativa de l’ambient.
  • Seqüenciació de metatranscriptomes. Ens proporciona els perfils d’activitat funcional en mostres complexes.
  • Seqüenciació de miRNAs, siRNA i altres xicotets RNAs. Especialment per a l’estudi de la regulació postranscripcional de l’expressió gènica.
  • Panells de gens. Útil amb genomes coneguts, on es dissenyen panells per a amplificar gens específics a alta resolució, on es poden distingir fàcilment mutacions, fins i tot aquelles de baixa freqüència.

Seqüenciadors de tercera generació

En FISABIO comptem amb dues plataformes d’aquesta generació:

ONT MinIon sequencer

Oxford Nanopore MinION

És una tecnologia basada en la creació de porus artificials de membrana pels quals es fa passar la seqüència de l’àcid nucleic a seqüenciar. La determinació de la seqüència es basa en el mesurament dels canvis de corrent elèctric entre les dues cares de la membrana on està immobilitzat el porus. El major avantatge d’aquesta tecnologia radica en la seua miniaturització i en la seua rapidesa (produeix dades en temps real). Això ens permet dues coses, d’una banda que siga totalment transportable en tindre la grandària d’una memòria USB (només en alguns dels seus models) i connectar-se directament a qualsevol ordinador per mitjà d’un port USB. I d’una altra, que siga idoni per a la detecció immediata d’organismes patògens in-situ o en aplicacions en les quals el temps de resposta siga un factor vital. Encara que presenta valors de qualitat de seqüència inferiors als d’altres plataformes, aquest fet pot ser solucionat mitjançant la seua combinació amb seqüències procedents de la tecnologia Illumina.

Pacific Biosciences PacBio Sequel II

Es basa en la lectura de la fluorescència emesa durant la síntesi de DNA per part d’una polimerasa immobilitzada al centre d’un pouet microscòpic. Els nucleòtids que es van incorporant a l’ADN motle, segons el seu tipus (A, T, G o C), emeten llum fluorescent de diferents colors. D’aquesta manera se seqüencia una única molècula per pouet en temps real (Single Molecule Real Time, SMRT). Les seqüències que obtenim del Sequel II tenen una longitud que va des de les 4000 pb, fins a extrems de 500,000 pb, en un temps màxim de 90 hores. Els nous seqüenciadors de PacBio (sèrie Sequel) han aconseguit erradicar el problema de la baixa qualitat, històricament típic dels seqüenciadors de tercera generació, i presenta un nou mètode anomenat Hi-Fi en aquest seqüenciador, on la mateixa molècula és seqüenciada diverses vegades de manera circular generant un consens d’alta qualitat autocorregit (seqüenciació CECS).

Les aplicacions aconsellades per a aquesta plataforma se sobreposen amb les esmentades prèviament per a Illumina, amb algunes millores: la seqüenciació de genomes complets pot ser de qualsevol grandària i naturalesa, tant procariotes com eucariotes. També, s’aconsella el seu ús per a la cerca de variants estructurals complexes; la descripció de comunitats microbianes i de fongs en un ecosistema per mitjà de la seqüenciació dels gens ribosomals complets (16S, 18S, incloent-hi fins als operons ribosomals complets), o uns altres amplicons d’interés; la metagenòmica i la transcriptòmica.

Esperem que us haja sigut d’interés aquesta entrada. Pròximament us presentarem amb detall els serveis bioinformàtics que oferim, així com notícies sobre noves tecnologies i plataformes emergents, sense oblidar-nos de tutorials pràctics per a aquelles i aquells que vulgueu aprendre més bioinformàtica i analitzar les vostres pròpies seqüències.

Si teniu algun dubte o comentari, no dubteu a escriure’ns! També si teniu idees sobre el que voleu anar llegint en el nostre blog. Estarem encantats d’escoltar-vos i contestar-vos.